До клиническое токсикологическое исследование лекарства Мак-Цир

Изучение острой токсичности предполагает установления вредного воздействия испытуемого средства, проявляющегося после его однократного или повторного применения через короткие (не более 6 часов) интервалы в течении суток. Целью изучения острой токсичности является изучение различных доз испытуемого средства с определением LD50, описанием клинической картины общерезорбтивного действия и установления причин гибели животных.

Исследование острой токсичности, кумуляции и общерезорбтивного действия лекарства «Мак-Цир» проведено согласно «Правил доклинической оценки безопасности фармакологических средств. РД-64-126-91. Москва, 1992 г.».

Методика. Под наблюдением 48 белых беспородных мышей, разделенных на 6 групп пол 8 особей в каждой. Лекарство «Мак-Цир» вводили в восходящих дозах из расчета на 20.0 г массы тела мыши. Для точности производили индивидуальное взвешивание мышей.

Лекарство «Мак-Цир» вводили через рот в виде 26% взвеси в дистиллированной воде. Мышам 1 группы вводили 0.65 мг\кг; мышам 2 группы – 1.3 мг\кг; мышам 3 группы- 2.6 мг\кг; мышам 4 группы – 5.2 мг\кг; мышам 5 группы-10.4 мг\кг; что в 200, 400, 800, 1600, 3200 раз соответственно превышает дозы, рекомендованные для человека. 6 группа – контроль Aq.d.-0.8 мл. Срок наблюдения 14 дней.

Результаты исследования. Объем лекарства «Мак-Цир», вводимый per os соответственно индивидуального веса мышей, приводится в таблице №1.1

Индивидуальная масса(г) тела мышей и соответствующий ей вводимый объем(мл) лекарства «Мак-Цир»

В связи с отсутствием гибели животных точно установить LD50 не представляется возможным. LD50 превышает при введение per os 3200-кратную дозу-208.0 мг на 20.0 массы мыши, т.е. 10496.0 мк\кг.

 

2. Определение кумуляции лекарства «Мак-Цир»

Методика. Под наблюдением 48 белых беспородных мышей, содержащихся в Мак-Цир условиях вивария на стандартном пищевом рационе. Лекарство «Мак-Цир» в виде 26% взвеси вводили через рот в восходящих дозах (из расчета на 20.0 массы тела мыши) пяти сериям мышей по 8 особей; дозы 0.65 мг/кг, 1.3 мг/кг, 2.6 мг/кг, 5.2 мг/кг, 10.4 мг/кг массы тела животного.

Таблица № 2.1.

 

№	3200-x		1600-x		800-x		400-x		200-x2
	P	V	P	V	P	V	P	V	P	V
1	15,00	0,60	12,00	0,24	12,00	0,12	14,00	0,70	11,00
2	20,00	0,80	18,00	0,36	18,00	0,18	13,00	0,07	13,00
3	16,00	0,60	12,00	0,24	19,00	0,19	16,00	0,08	16,00
4	22,00	0,90	12,00	0,24	20,00	0,20	17,00	0,09	13,00
5	20,00	0,80	15,00	0,30	20,00	0,20	18,00	0,09	16,00
6	20,00	0,80	15,00	0,30	16,00	0,16	15,00	0,08	17,00
7	20,00	0,80	16,00	0,32	17,00	0,17	16,00	0,08	13,00
8	14,00	0,60	17,00	0,34	15,00	0,15	16,00	0,08	18,00

Через 24 часа: все животные живы, активны, рефлексы нормальной высоты, едят охотно.

Кумуляция, 2 введение тех же доз.

Через 48 часов: все животные живы, активны, рефлексы нормальные реакция на внешние раздражители адекватные, корм потребляют охотно.

Кумуляция, 3 введение тех же доз.

Через 72 часа: все животные живы, спонтанная двигательная активность хорошая, реакция на внешние раздражители адекватные, корм потребляют охотно. В связи с отсутствием падежа LD50 кумуляции при введение лекарства «Мак-Цир» точно определить не возможно. Оно превышает в 9600 раз терапевтическую дозу, то есть превосходит 31488 мг\кг.

Мыши 4, 5, 6 групп подвергнуты эвтаназии путем декапитации для патоморфологического и гистоструктурного анализа.

До эфтаназии. Шерсть чистая, блестящая, гладкая.

На секции: ткани розового цвета, жировая ткань развита средне. Серозные полости: влажные, блестящие, жидкости нет, кровоизлияний и изъязвлений не отмечается. Паренхиматозные органы влажные, блестящие, на разрезе соскоба не дают. Мочевой пузырь полный, моча прозрачная. Желудочно-кишечный тракт: слизистая пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки розовая, бархатистая, кровоизлияний, изъязвлений нет.

Гистологическое исследование.

Ткани паренхиматозных органов равномерно эозинофильны, ядра интенсивно воспринимают красители; в легочной ткани и в сердечной мышце свежие кровоизлияния (от забоя).

Сердце: цитоплазма кардиомиоцитов равномерно окрашена эозином, ядра окрашены ярко гематоксилином. Признаки нарушения капиллярного кровообращения не обнаружены. Просветы магистральных кровеносных сосудов свободные, что указывает в том числе на хорошую сократительную способность миокарда.

Почки: эпителий канальцев равномерно эозинофилен, ядра хорошо воспринимают красители. Сохранена нормальная гистологическая структура. Кровоизлияний нет, признаков сдавления клеток (отека) не обнаружено.

Печень: гепатоциты интенсивно воспринимают красители, кровоизлияний нет, нормальная гистологическая структура не нарушена, расположение балок нормальное. Нарушений кровообращений не наблюдается.

Легкие: альвеолярные полости свободные, жидкости нет, эпителий бронхиального дерева красится интенсивно. Единичные участки свежих кровоизлияний от декапитации. Признаки нарушения кровообращения не обнаружено.

Селезенка: соотношение красной и белой пульпы сохранено, ткани интенсивно воспринимают красители, кровоизлияний нет.

Кожа: нормальная гистологическая структура не нарушена, кровоснабжение достаточное, кровоизлияний нет.

Резюме

Результаты изучения острой токсичности и кумуляции при пероральном введение лекарства «Мак-Цир» указывают на полное отсутствие как токсического эффекта и кумуляции при введении, что свидетельствует о значительной терапевтической широте средства «Мак-Цир». Патоморфологическое и гистоструктурное исследование подтверждают отсутствие токсического эффекта при применении 9600-кратных терапевтических доз лекарства «Мак-Цир» в течении 3-х дней.

4. Определение хронической токсичности лекарства «Мак-Цир»

Методика. Под наблюдением 10 кроликов: 7 опытных и 3 контрольных, породы шиншилла средним весом 2000г. Животных содержали в условиях вивария на стандартном пищевом режиме. После определения исходных параметров, животным вводили через зонд в желудок 26% взвесь «Мак-Цир» из расчета 50-кратной терапевтической дозы, что соответствует 164.0 мг\кг (терапевтическая доза «Мак-Цир» составляет 3.28 мг\кг ежедневно в течении 14 дней.

Для точной дозировки испытуемого средства его вводили строго согласно индивидуальной массы тела животных. В таблице 4.1.1 приводим объем вводимой 26% взвеси лекарства «Мак-Цир», индивидуально рассчитанный для каждого животного.

Таблица 4.1.1

 

№	Масса тела (г)	Объем (мл)	№	Масса тела (г)	Объем (мл)
1	2450	1,5	1	2000	1,2
2	1690	1,0	2	1500	1,0
3	1590	1,0	3	1600	1,0
4	1690	1,0	4	1720	1,1
5	2600	1,5	5	2400	1,5

В процессе наблюдения за хронической токсичностью животных взвешивали и определяли ректальную температуру тела через день. Согласно изменениям массы тела делали индивидуальный перерасчет и корректировку вводимых объемов лекарства «Мак-Цир».

 

4.1.1. Внешний вид животных.

Методика. При визуальном ежедневном наблюдении обращали внимание на состояние волос, крепость соединения волос с кожей, наличие выпадения, участков облысения. При осмотре кожи обращали внимание на ее цвет, целостность покрова, наличие или отсутствие его дефектов, изъявлений, кровоизлияний в кожу в виде точечных петехий, пятен, полос, изменение рисунка сосудистой сети в виде его усиления; при осмотре слизистых оболочек: коньюнктиву глаза, полости рта и носа, фиксировали их целостность, окраску, характер и количество отделяемого, рисунок сосудистой сети, наличие или отсутствие изъявлений, кровоизлияний, расширение сосудов.

Результаты исследований. При ежедневном наблюдении за внешним видом животных никаких особых изменений отмечено не было. Волосяной покров за весь период наблюдения сохранял чистоту и гладкость, был блестящим. Волосы не выпадали, участков облысения не образовывалось. Кожа сохраняла обычный цвет, дефектов, изъявлений и кровоизлияний на ней не отмечалось. Рисунок сосудистой сети обычный, не усиленный. Слизистая оболочка полости рта и носа розовая, чистая, влажная, без кровоизлияний и изъявлений, сосуды не расширены, коньюнктива глаз гладкая, блестящая, налетов и кровоизлияний нет. Рисунок сосудов не изменен.

 

4.1.2. Поведение. Симптомы интоксикаций.

Методика. Наблюдение над поведением подопытных кроликов проводили ежедневно. При этом учитывали их спонтанную двигательную активность: ее понижение, повышение, бег, прыжки, адинамию, судороги, их характер (клонические, тонические), продолжительность и частоту, координацию движений (боковое положение, нарушение походки, ее скованность, каталепсия),почесывание морды, экзофтальм, птоз, размер зрачка. Сопротивление иммобилизации и проводимым процедурам. В неделю один раз вели учет потребления пищи и воды.

4.1.3. Изменение массы и температуры тела.

Методика. Прирост массы тела кроликов определяли путем взвешивания через день. В этот же период производили термометрирование животных с помощью электротермометра и ректального датчика, который вводили в прямую кишку на глубину 7-см после предварительного смачивания вазелиновым маслом.

Результаты исследования. Результаты, установленные в процессе наблюдения за изменениями массы тела кроликов, получавших лекарство «Мак-Цир» приведены в таблице 4.1.3.1.

В таблице 4.1.3.2. приведены колебания температуры тела кроликов, имевшее место в период введения животным лекарства «Мак-Цир».

Из таблиц №№4.1.3.1. и 4.1.3.2. видно, что за период введения лекарства «Мак-Цир» масса тела кроликов и их температура не претерпевали существенных изменений.

Таблица №4.1.3.1.					Таблица №4.1.3.2.
№	Дни исследования велич. Массы тела (г)				№	Дни исследования температуры тела (С)
	Исходн.	8	14			Исходн.	8	14
1	2450	2500	2740		1	38,0	38,0	38,0
2	1690	1800	1970		2	38,0	38,1	38,0
3	1590	1600	1650		3	38,1	38,0	38,1
4	1690	1680	1700		4	38,0	38,0	38,1
5	2600	2690	2770		5	38,1	38,0	38,0
6	2000	2000	2190		6	38,2	38,2	38,1
7	1500	1540	1650		7	38,0	38,0	38,1
8	1600	1820	1870		8	38,0	38,0	38,1
9	1720	1730	1770		9	38,1	38,1	38,0
10	2400	2550	2700		10	38,0	38,2	38,0

 

4.1.4. Состояние мышечного тонуса

Методика. До и после введения лекарства «Мак-Цир» ежедневно определяли тонус скелетных мышц, тургор ушей, отмечали наличие гипотонуса или гипертонуса мышц конечностей, тризма жевательных мышц, положение хвоста, гиперкинезы хореотического типа в отдельных группах мышц: глазодвигательных, лицевых, плечевого пояса, головы, пальцев конечностей.

Результаты исследования. За весь период наблюдения изменений в состоянии тургора ушей и мышечного тонуса скелетных мышц ни в одном случае отмечено не было. Так же ни разу не наблюдали тризма жевательных мышц и гиперкинезов хореотического типа в отдельных группах мышц.

 

4.1.5. Состояние безусловных рефлексов и ответных реакций на внешние раздражители.

Методика. Состояние безусловных рефлексов организма кроликов в период введения лекарства «Мак-Цир» учитывали по состоянию вегетативных функций организма-саливации, чихания, частоты и глубины дыхания, патологических ритмов дыхания, частоты сердцебиений и нарушения ритма сердцебиений, количества и консистенции фекальных масс, частоты мочеиспускания и окраски мочи. Изучали так же рефлекторные реакции на внешние раздражители: звуковые, световые, тактильные, болевые.

Результаты исследования. За период наблюдения ни в одном случае не отмечено изменения в вегетативной сфере и рефлекторных реакциях на внешние раздражения. У кроликов сохранялись на исходном уровне показатели вегетативных функций организма: саливация и чихание отсутствовали; ритм и глубина дыхания, а также частота сердцебиений и параметры выделительной сферы соответствовали исходным величинам.

У животных наблюдали ориентировочные реакции разного характера, а также комплекс движений, связанный с положительными эмоциями, рефлексами умывания и причесывания. Рефлексы роговые, зрачковые, слуховые, тактильные болевые на протяжении всего периода исследования были живыми и адекватными.

 

Резюме.

Проведенные исследования показали, что при ежедневном введении лекарства «Мак-Цир» внутрь кроликам в течении 14 дней в дозе, превышающей терапевтическую в 50 раз не отмечено каких-либо изменений в указанных показателях.

 

4.1.6. Морфологические и гистоструктурные изменения у кроликов в ходе определения хронической токсичности лекарства «Мак-Цир»

Морфологические исследования. Шерсть чистая, блестящая. На секции (три кролика): внутренние органы расположены правильно, слизистая оболочка ткани расположены правильно, слизистая оболочка и ткани розового цвета. Плевра и брюшина гладкие, чистые, влажные, в полостях жидкости нет. Легкие розовые; сердечная мышца упругая; печень, селезенка не увеличены, поверхность гладкая, чистая, на разрезе соскоба не дает. Почка без изменений. Мочевой пузырь полный, моча прозрачная. Слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта чистая, бархатистая, розовая, кровоизлияний и изъявлений нет.

Гистологическое исследование. Паренхиматозные органы без структурных изменений, ткани красятся интенсивно. Желудочно-кишечный тракт: структурных изменений не обнаружено. Эпителий без изменений, красители воспринимаются интенсивно. В сумбукозном слое обнаруживаются лимфоциты, скоплениями. Тимус: между септами жировая ткань в незначительном количестве. Ткань инфильтрирована лимфоцитами и макрофагами. Лимфоциты красятся интенсивно. Создается впечатление увеличения количества лимфоцитов в органе.

 

Резюме.

Патоморфологическими и гистоструктурными исследованиями подтверждено отсутствие токсического эффекта на организм кроликов при ежедневном 14 дневном введении лекарства «Мак-Цир» в дозе, превышающей терапевтическую дозу в 50 раз.

 

4.2. Определение местно-раздражающего действия лекарства «Мак-Цир»

С целью определения возможного местно-раздражающего действия лекарства «Мак-Цир», были использованы мыши и кролики, получавшие «Мак-Цир» per os в ходе определения как острой так и хронической токсичности, а также определения кумуляции. При этом использован широкий диапазон доз от 200-кратной рекомендованной разовой терапевтической дозы, до 9600-кратной.

У всех забитых декапитаций подопытных и контрольных животных с помощью лупы производили осмотр слизистой оболочки пищевода, желудка и кишечника. Макроскопическое исследование показало, что слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта нормально окрашена, гиперемии, отека, кровоизлияний и изъязвлений не отмечается; рельеф слизистой оболочки не отличается от контроля; тонус желудка сохранен.

Гистологическое исследование: структура всех слоев желудочно-кишечного тракта не нарушена, явления нарушения кровообращения не наблюдается, эпителий интенсивно воспринимает красители. Не отмечается никаких отклонений у подопытных животных по сравнению с контрольными животными

Таким образом, лекарство «Мак-Цир» в дозах значительно превышающих терапевтические при пероральном длительном введении не оказывает местнораздражающего действия на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, что установлено макроскопическим осмотром и микроструктурным исследованием.